Gracias por visitar nature.com.Está utilizando una versión de navegador con soporte limitado para CSS.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador más actualizado (o desactive el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilos ni JavaScript.Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13791 (2022) Citar este artículoLa bacteria Klebsiella pneumoniae (Kp) es una amenaza creciente para la salud pública y representa uno de los patógenos más preocupantes involucrados en infecciones potencialmente mortales y resistencia a los antimicrobianos (AMR).Para comprender la epidemiología de la RAM de Kp en Portugal, analizamos la secuenciación del genoma completo, las pruebas de susceptibilidad y otros metadatos de 509 aislamientos recopilados en todo el país en 16 hospitales y entornos ambientales entre los años 1980 y 2019. Los tipos de secuencia predominantes (ST) incluyeron ST15 (n = 161, 32 %), ST147 (n = 36, 7 %), ST14 (n = 26, 5 %) o ST13 (n = 26, 5 %), mientras que el 31 % de los aislamientos pertenecían a ST con menos de 10 aislamientos .Las pruebas de AMR revelaron una resistencia generalizada a los aminoglucósidos, las fluoroquinolonas, las cefalosporinas y los carbapenémicos.El gen de carbapenemasa más común fue blaKPC-3.Si bien la distribución de plásmidos vinculados a AMR parece no estar correlacionada con ST, su frecuencia ha cambiado con el tiempo.Antes del año 2010, el grupo de plásmidos dominantes estaba asociado con el gen de la betalactamasa de espectro extendido blaCTX-M-15, pero este grupo parece haber sido desplazado por otro portador del gen blaKPC-3.El transporte conjunto de blaCTX-M y blaKPC-3 fue poco frecuente.Nuestros resultados del mayor estudio genómico de Kp en Portugal destacan la transmisión activa de cepas con genes AMR y proporcionan un conjunto de referencia de variantes para futuros estudios epidemiológicos y de seguimiento de la resistencia.Klebsiella pneumoniae (Kp) es un patógeno gramnegativo común asociado con infecciones adquiridas tanto en el hospital como en la comunidad1.Durante las últimas décadas, la asociación de las bacterias Kp con la resistencia a los antibióticos se ha reconocido cada vez más junto con una variedad de mecanismos de resistencia2.La producción de genes transferibles lateralmente que codifican enzimas, como las enzimas modificadoras de aminoglucósidos, genera altos niveles de resistencia a los antibióticos aminoglucósidos3.Las mutaciones asociadas a la resistencia en las enzimas diana de las quinolonas (ADN girasa y topoisomerasa IV) están codificadas cromosómicamente por la región determinante de la resistencia a las quinolonas gyrA, gyrB y parC, así como por los genes de resistencia a las quinolonas mediados por plásmidos4,5.Las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) inactivan prácticamente todos los antibióticos betalactámicos (p. ej., penicilinas, cefalosporinas, pero no carbapenémicos).No obstante, lo más preocupante es el aumento en la prevalencia de aislamientos de Kp que producen carbapenemasas6, lo que limita en gran medida las opciones de terapias efectivas e impulsa los brotes hospitalarios que promueven una mayor propagación de la resistencia a los antimicrobianos (RAM)7,8.En el sur de Europa, tipo OXA-48, VIM y KPC son las familias de carbapenemasas dominantes9,10.El conocimiento del panorama de las carbapenemasas en Portugal es incompleto.Sin embargo, la prevalencia de aislamientos de Kp invasivos resistentes a carbapenémicos en Portugal aumentó del 3,4 % en 2015 al 10,9 % en 2019. Durante el mismo período, la proporción de aislamientos con resistencia combinada a cefalosporinas de tercera generación, fluoroquinolonas y aminoglucósidos (26,5 % en 2019 ) osciló sin tendencia alcista6.Varios estudios epidemiológicos pequeños recientes en Portugal se han centrado en aislados de Kp productores de carbapenemasas11,12,13,14,15,16, y blaKPC-3 fue el gen de resistencia a carbapenem identificado con mayor frecuencia.El gen blaKPC-3 se localiza con mayor frecuencia dentro del transposón Tn4401d, y las familias de plásmidos IncN, IncFII, IncFIB e IncFIIA son los principales traficantes11,13,15,17.La alta flexibilidad del genoma accesorio de Kp es una preocupación adicional porque actúa como puerta de entrada para la introducción de nuevos genes de resistencia en un conjunto más amplio de patógenos gramnegativos2.La secuenciación del genoma completo (WGS) ha revolucionado el estudio de patógenos, no solo a través de la caracterización de mutaciones y plásmidos asociados a AMR18,19, sino también a través de la determinación de filogenias y eventos de transmisión20,21.La filogenia Kp normalmente forma clados consistentes con el esquema de tipificación de secuencias multi-locus (MLST) de uso común, que se basa en siete loci de genes (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB y tonB)22.Los perfiles de serotipos de lipopolisacárido (tipo O) y polisacárido capsular (tipo K) pueden ser informativos para el desarrollo de vacunas, y se han predicho > 130 serotipos capsulares a partir de datos WGS con los serotipos KL2, o O1, O2, O3 y O5 que representan la mayoría. cepas23,24.Alternativamente, a veces se caracterizan grupos clonales (CG) basados ​​en 694 genes centrales25.Las cepas de diferentes tipos de secuencias (ST), tipos de antígenos O y K y CG pueden diferir considerablemente en su virulencia y propensión a ser resistentes a los antibióticos25.Por ejemplo, ST23, ST26, ST57 y ST163 se han relacionado con la hipervirulencia de Kp26.Desafortunadamente, el esquema Kp MLST ampliamente utilizado no permite una filogenia de alta resolución.La recombinación y la transferencia génica horizontal dentro de Kp también complica un análisis filogenético27, incluso dentro de las mismas ST28.Además, una gran parte del núcleo del genoma exhibe un polimorfismo muy limitado y los elementos genéticos móviles pueden tener una relevancia clínica relativamente mayor, como lo demuestran los factores de virulencia y AMR27.En términos más generales, estos incluyen elementos integrativos conjugativos (ICE), que son un grupo diverso de elementos genéticos móviles autotransmisibles integrados cromosómicamente que están activos en la configuración de las funciones de las bacterias y las comunidades bacterianas, incluso en Kp.El estudio actual tiene como objetivo mejorar la comprensión del panorama genómico y AMR de Kp en Portugal mediante el análisis del conjunto de datos WGS más grande hasta la fecha, que consta de 509 aislamientos que abarcan un período entre los años 1980 y 2019. Examinamos la prevalencia de ST, genes asociados con AMR y virulencia, y cómo los perfiles de AMR se relacionan con las firmas de replicón de plásmido de los aislamientos.Encontramos que aunque predominan ST15, ST14 y ST147, casi un tercio de los aislamientos procedían de ST consideradas poco frecuentes en Portugal.Establecemos que hay muchos determinantes de RAM, que están evolucionando con el tiempo, y nuestro trabajo proporciona un conjunto de referencia de variantes para futuros estudios epidemiológicos y de seguimiento en Portugal y Europa en general.Este estudio incluye un total de 509 aislamientos Kp.De estos, 459 son aislamientos clínicos de hospitales en las regiones sur (n = 378), central (n = 20) y norte (n = 61) de Portugal (Tabla 1).Estos se compararon con aislamientos recolectados de clínicas veterinarias (n = 41) y aguas residuales ambientales (n = 9) de la región sur, ampliando así los conocimientos sobre la incidencia de Kp en Portugal.Los aislamientos se recolectaron entre los años 1980 y 2019, pero la mayoría (n = 455, 89%) se recolectaron entre 2000 y 2019 (Cuadro 1).De los tipos de antígeno O, O1 fue dominante con los serotipos O1v1 (44%) y O1v2 (20%), seguidos por los serotipos O2v2 (12%) y O2v1 (10%) (Tabla 1).Se infirieron 77 ST diferentes, siendo los más frecuentes ST15 (n = 161), ST147 (n = 36), ST13 (n = 26) y ST14 (n = 26) (tabla 1).El grupo clonal globalmente significativo 258 tuvo poca presencia, con un 4% de aislamientos pertenecientes a ST11 y ninguno a ST258 o ST512.Una alta proporción de aislamientos (31 %) procedían de ST de baja frecuencia (cada uno < 2,0 %).De 2926 posibles pares únicos de ST, solo el 0,7 % diferían en un solo alelo, mientras que el 22,7 %, el 32,8 % y el 25,7 % diferían en 4, 5 y 6 alelos, respectivamente (Fig. S2).Los serotipos O se vincularon fuertemente con las ST (Fig. S3).Solo 10 ST tenían aislamientos con diferentes serotipos O.ST15 (n = 161) tuvo 149, 9 y 3 aislamientos con los serotipos O1v1, O1v2 y O1/O2v1, respectivamente.ST13 (n = 26) tuvo 25 y 1 aislamiento con los serotipos O1v2 y O1v1, respectivamente.ST14 (n = 26) tuvo 24 y 2 aislamientos con los serotipos O1v1 y O1/O2v1, respectivamente.ST348 (n = 22) tuvo 19 y 3 aislamientos con los serotipos O1v1 y O1/O2v1, respectivamente.ST11 (n = 19) tuvo 13, 5 y 1 aislamiento con los serotipos O2v2, O3b y O4, respectivamente.Hubo otros cinco ST (34 aislados) que contenían aislados con diferentes serotipos O.Los serotipos K capsulares predominantes fueron KL112 (14%) y KL24 (19%), ligados al común ST15.Al considerar solo las combinaciones únicas de ST y grupo K (n = 105), los serotipos K más frecuentes fueron KL30, KL10 y KL24 observados en 7, 7 y 5 ST, respectivamente.El árbol filogenético general (n = 509) es en gran medida congruente con el tipo ST, pero la propensión de Kp a recombinarse significa que los valores de soporte de las ramas disminuyen rápidamente a medida que uno se mueve de las hojas a la raíz (Fig. S3).Los árboles ST individuales (Fig. 1A–D) identificaron varios clados geográficos bien respaldados, incluidos dos brotes potenciales informados anteriormente8,14 en los hospitales de Lisboa y Vila Real que involucraron a representantes de ST147 y ST15.Para la secuencia más abundante tipo ST15 (n = 161), el árbol muestra múltiples clados diferenciados por serotipos K (Fig. 1A).Casi todos los aislamientos portaban blaCTX-M-15, excepto los aislamientos de los años 1980 a 1982 y 5 de 14 aislamientos de los años 2007 a 2018 con blaKPC-3.Debido al bajo número de aislamientos que abarcan los años 1990 a 1999, es posible que nuestro conjunto de datos no refleje completamente la diversidad de betalactamasas durante ese período.Se ha sugerido que blaTEM-10 era el gen ESBL dominante en ese momento, y la mayoría de nuestros aislamientos (11/16) lo portaban.El clado más pequeño (n = 9) era del norte de Portugal y se distinguió por los serotipos KL19 y O1v2 con cinco aislamientos portadores de blaKPC-3.Los otros aislamientos de ST15 portadores de blaKPC-3 (n = 9) eran filogenéticamente muy distantes y formaban parte de un clado más grande (n = 67) con los serotipos K112 y O1v1.Curiosamente, estos nueve aislamientos portaban tanto blaKPC-3 como blaCTX-M-15, en contraste con todos los demás aislamientos relevantes, que portaban blaKPC-3 o blaCTX-M-15 (Fig. 2).Cuatro de las nueve muestras de aguas residuales pertenecían a ST15 y estaban dispersas entre las muestras clínicas en el árbol filogenético ST15 (Fig. 1A).Árboles filogenéticos de los tipos de secuencia más comunes (ST), su fenotipo de resistencia antimicrobiana (AMR) y perfiles genotípicos de carbapenemasas y ESBL.K-Loci se refiere a los serotipos K inferidos.Los colores de las ramas representan valores de soporte de arranque.Los genes ESBL (blaCTX-M-15) y carbapenemasas (blaKPC-3) más comunes en los aislamientos de 509 Kp por grupo de año.La mayoría de los aislamientos de ST14 (n = 20/26) cayeron dentro de dos clados dominantes (Fig. 1B);el primer clado (n = 11) se obtuvo del norte de Portugal en el año 2018 y contiene el locus K16, y el segundo (n = 9) se distinguió por el serotipo K2 y abarcó los años 1980 a 2010. Solo el segundo clado tenía blaKPC- 3 portadores de aislamientos (n = 6).A diferencia de otras ST, los genes utilizados en la reconstrucción filogenética de ST14 se concentraron relativamente dentro de una región cromosómica de 3,60 Mbp a 3,75 Mbp basada en el ensamblaje NC_016845.1 Kp (Fig. S1).Todos los aislamientos de ST147 (n = 36) tenían los serotipos KL64 y O2v1 y pertenecían a dos clados principales.Un clado consistió en aislamientos de la región norte (n = 15) del año 2018, todos los cuales portaban blaKPC-3, pero solo uno tenía blaCTX-M-15 (Fig. 1C).Todos los aislamientos de este clado portaban el locus sideróforo yersiniabactina (ybt 16; ICEKp12) relacionado con la virulencia.Un segundo clado (n = 20) se obtuvo de la región sur y abarcó los años 1995 a 2016. Solo 11 aislamientos en este clado portaban blaKPC-3 y ninguno tenía el locus de yersiniabactina.De manera similar, el árbol ST13 tenía dos clados caracterizados por el serotipo KL3 (Fig. 1D).Un clado (n = 10) se obtuvo de varios hospitales en el año 2019, y todos los aislamientos portaban loci de blaKPC-3 y yersiniabactina.Otro clado (n = 13) abarcó los años 1982 a 2013 y provino de la región sur.Solo dos aislamientos en este clado portaban blaCTX-M-15 y ninguno tenía otros genes ESBL, blaKPC-3 o el locus de yersiniabactina.A diferencia de los aislamientos ST13 restantes, estos dos aislamientos filogenéticamente distantes tenían serotipos K57 y K30 inferidos.Nuestro conjunto de datos incluía cuatro aislamientos del tipo ST1138, un ST que se describió previamente en dos hospitales en Portugal13.También teníamos ST6003 no descrito previamente (n = 3), que difiere de ST1138 por un alelo rpoB.Los siete aislamientos se recolectaron en 2012 del mismo hospital en Lisboa.Sorprendentemente, uno de los aislados de ST1138 no tiene genes AMR ni mutaciones aparte de blaSHV-36.Esto sugiere que sus antepasados ​​se introdujeron recientemente en el sistema hospitalario.Esta cepa original se ha dividido en al menos dos linajes, ambos portadores de blaKPC-3, pero no está claro si esta adquisición fue independiente en cada linaje.Hay al menos dos linajes inferidos porque los aislamientos de fechas superpuestas tienen uno de los dos tipos de alelos rpoB (indicados como alelos 1 o 46).No identificamos ningún aislado de ST1138 posterior a 2012 en nuestros datos, pero parece haber estado presente en los aislados portugueses recolectados en el año 201113. Además de ST6003, nuestro conjunto de datos tenía dos variantes de un alelo más de ST1138: ST514 (n = 2) recolectado de pacientes hospitalarios en la década de 1980 y ST323 (n = 1) recolectado de aguas residuales en 2018. Tanto ST514 como ST323 provenían de la misma área geográfica que los tipos de secuencia ST1138 y ST6003.De las 48 familias de replicón identificadas por el software PlasmidFinder, seis ocurrieron en al menos el 10 % de los aislamientos (IncFIB 98 %, IncFII 96 %, IncFIA 55 %, IncR 42 %. IncHI1B 11 %, IncN 10 %).Se identificó un promedio de 4 replicones (rango: 0–9) por aislamiento y solo tres aislamientos no tuvieron ninguno.Para comprender el patrón de replicones de plásmidos entre aislamientos, aplicamos métodos de reducción dimensional UMAP29 a matrices de presencia-ausencia de la familia de replicón (n = 48) y secuencias de replicón únicas (n = 240).Los resultados basados ​​en familias y secuencias exactas de replicón fueron consistentes;así que aquí presentamos el análisis de mayor resolución utilizando secuencias de replicón (Datos S1).Observamos nueve grupos claros y robustos (grupos de replicón, RC) (Fig. 3A).La prevalencia de RC varió con el tiempo (Fig. 3B) con RC9, el grupo con 94% de portador de blaKPC-3, que se volvió dominante entre los años 2010 y 2019. Al superponer el tipo de RC en los árboles filogenéticos generales y específicos de ST, se revelaron distribuciones de mosaico, más apoyando el movimiento de plásmidos entre los linajes Kp (Fig. 1A-D).(A) Agrupación de aislamientos por su replicón de plásmido (agrupaciones de replicón, RC) y perfiles genotípicos de resistencia a los antimicrobianos (AMR), que revelan la diferenciación por transporte de los genes blaKPC-3 y blaCTX-M-15.Los ejes X e Y son dimensiones en las que se proyectan datos completos, no tienen unidades;(B) Abundancia de aislamientos de diferentes grupos de plásmidos.RC1 contenía el 57 % de todos los aislados (n = 288), pero muy pocos (n = 9) aislados tenían blaKPC-3;aunque el 59 % portaba genes que codifican ESBL, lo que es consistente con los aislamientos tempranos que dominan este grupo.La frecuencia de aislamientos en este grupo ha disminuido sustancialmente después del año 2001. RC1 tiene una gran diversidad de replicones de plásmidos que incluyen IncFIB(K) (n = 214), IncFII(K) (n = 174), IncR (n = 108), y CoI (pHAD28) (n = 108) con cada familia de replicón que consta de múltiples clados filogenéticos distintos que hacen que la interpretación de RC1 sea compleja.Por el contrario, el grupo RC9 (n = 87) tiene 25 ST diferentes, incluidos los tipos dominantes ST15, ST147 y ST14.Casi todos los Kp en el grupo RC9 (94%, 82/87) llevan blaKPC-3.Este gen está ausente en 5 aislamientos: ST14 de 2007 y 2010;ST416 de 2011;ST1138 de 2012;y ST359 de 2018. La firma clave de RC9 es la presencia de variantes de replicones FIA (pBK30683) y FII (pBK30683) (Datos S1).Para los aislados con blaKPC-3 en RC9, más de un tercio (31/87) eran ST diversas recolectadas entre los años 2010 y 2019, pero que no poseían mutaciones gyrA ni un gen aac(6')-Ib-cr.Estos aislamientos fueron susceptibles a las fluoroquinolonas con diámetros de zona de inhibición promedio de 20 mm entre 27 aislamientos probados.El grupo RC5 (n = 14) consistía en ST147 que llevaba blaKPC-3 y era congruente con el clado procedente del norte de Portugal en el año 2018 (n = 15).De estos aislamientos del norte de Portugal, 14 pertenecían a RC5 y uno pertenecía a RC1 (Fig. 1C).El grupo RC5 es identificable por dos variantes de replicones IncN e IncFIB (pKPHS1) (Datos S1).IncN es poco común en nuestro conjunto de datos (51/2222 replicones) y su fuerte vínculo con blaKPC-3 sugiere, en línea con informes anteriores15,30, que blaKPC-3 puede ser movilizado por plásmidos IncN.Por el contrario, otros grupos tenían tipos de ST homogéneos: RC2, RC3, RC7 y RC8 consisten en 57, 24, 11 y 8 aislamientos de ST15;RC6 consta de diez aislados de ST14;y RC4 de nueve aislados de ST12.RC3 es interesante porque a pesar de tener aislamientos de los años 2003 a 2014, solo uno (1/24) tenía una betalactamasa tipo blaSHV (blaSHV-11).Estos genes son muy comunes (87,4%) y normalmente son cromosómicos, lo que sugiere la pérdida de blaSHV o la circulación simultánea de varias cepas.Todos los aislamientos de RC2 portaban replicones IncFIB(K) e IncFII(pKP91), donde las variantes asociadas eran diferentes a las de los replicones RC1.La variante RC2 IncFIB(K) también estuvo presente en los aislamientos RC8 y RC7.Los aislamientos RC7 también portaban una variante distinta de un replicón Col440I, y una variante de IncR se comparte con RC1, RC2, RC3 y RC8.RC8 llevaba una versión distinta de los replicones IncFII(K) e IncFIB(pQil).Finalmente, además de las variantes compartidas de IncR y ColpVC, RC3 también transportaba replicones IncHI1A e IncHI1B (R27), que estaban ausentes en otros grupos (Datos S1).Los perfiles y genotipos de AMR in vitro se analizaron para los aislamientos de 509 Kp, con algunas lagunas según la década de evaluación fenotípica (Tabla S1).La mayoría de los aislamientos se sometieron a pruebas de sensibilidad a los antibióticos para aminoglucósidos (n = 356, 68,1 %), cefalosporinas (n = 366, 71,2 %), fluoroquinolonas (n = 344, 66,9 %), carbapenémicos (n = 296, 57,6 %) y penicilinas ( n = 311, 60,5%) (Tabla S1).Sin embargo, 121 aislamientos no tenían datos de susceptibilidad a AMR.Dado que las pruebas de AMR se realizaron durante varios años, la concentración de compuestos activos en los discos utilizados puede variar entre los aislamientos;todos los puntos de corte se determinaron en base a EUCAST v11.0 (2021)31.La mayoría (75 %) de los 304 aislamientos analizados mostró susceptibilidad al imipenem;un antibiótico ampliamente utilizado en la práctica clínica hospitalaria en Portugal (fig. 4).El controlador de resistencia probablemente fue blaKPC-3 (n = 106), que se transportó en un transposón Tn4401d en casi todos los casos (n = 101/106).En cuatro aislamientos [ST15 (Kp5149), ST147 (Kp5147), ST34 (Kp5148) y ST461 (Kp5162)], el gen blaKPC-3 ha sufrido una inversión idéntica dentro de la estructura Tn4401d.Solo uno de estos cuatro aislamientos (ST147) se analizó para determinar la resistencia al imipenem y se determinó que era resistente (diámetro de la zona de inhibición de 6 mm).Esta observación sugiere que la inversión no perjudicó significativamente la resistencia conferida por la presencia de blaKPC-3.Además, nuestro conjunto de datos contenía tres aislamientos sin genes de carbapenemasa pero resistentes a imipenem.Estos tres aislamientos no tenían una similitud clara entre ellos, ni una distinción clara de los aislamientos susceptibles con un genotipo similar.Distribución de los diámetros de la zona de inhibición para diferentes genotipos para (A) imipenem, (B) cefotaxima, (C) cefoxitina, (D) ciproflocaxina y (E) antimicrobianos gentamicina.La resistencia a las cefalosporinas estaba muy extendida; el 68 % de los 335 aislamientos analizados mostraron resistencia a la cefotaxima, una cefalosporina de tercera generación, impulsada probablemente por la presencia de ESBL blaCTX-M-15 de clase A (n = 213, 41 %) (Fig. 4) .La ceftazidima tuvo una prevalencia de resistencia aún mayor del 91 %.Este fármaco se usó ampliamente en la década de 1990 para los brotes de Pseudomonas, pero en la actualidad rara vez se usa en monoterapias.La combinación de ceftazidima y el inhibidor de carbapenemasas avibactam (cazAvb) rara vez fue resistente (1/46 pruebas).El aislado resistente (ST15) portaba blaOXA-1, blaTEM-1, blaSHV-28 y tenía el gen de porina truncado ompK36.De los aislamientos resistentes a imipenem, doce fueron probados para cazAvb y todos fueron susceptibles.Finalmente, la cefoxitina de cefalosporina de segunda generación presenta un caso interesante debido a que su perfil de resistencia con frecuencia era inconsistente con su perfil genómico o genotípico (Fig. 4).De 366 aislamientos probados, 8 portaban AmpC beta-lactamasa blaDHA-1, que se asocia con una fuerte inhibición de cefoxitina.De acuerdo con esto, estos 8 aislamientos tenían un diámetro de zona de inhibición de cefoxitina de 6 mm.Sin embargo, el diámetro de la zona de inhibición de los aislados portadores de blaKPC-3 probados (n = 74) fue en promedio de 13 mm, que está por debajo del punto de corte de 19 mm, pero muy por encima del diámetro de inhibición total de 6 mm.En aislamientos con betalactamasas de clase A (no de amplio espectro, de amplio espectro, BLEE) y D, la susceptibilidad a la cefoxitina varió enormemente y los aislamientos que contenían las cuatro categorías tenían una distribución casi uniforme de los diámetros de la zona de inhibición entre 25 y 6 mm.Pudimos rastrear parte de esta inconsistencia hasta 83 aislamientos con blaSHV-28.El diámetro medio para aislamientos con genes clase A de amplio espectro, clase A BLEE y clase D es de 22 mm.Si este genotipo también incluía blaSHV-28 (clase A), el diámetro medio de la zona de inhibición se reducía a 16 mm, pero este efecto está ausente para otras variantes de blaSHV.De los 307 aislamientos probados para la susceptibilidad a la ciprofloxacina, 288 (94%) fueron resistentes (Fig. S4).Cinco aislamientos no tenían ningún determinante común de resistencia a las fluoroquinolonas y todos eran susceptibles con un diámetro de zona de inhibición de entre 22 y 30 mm.Con mucho, el determinante más fuerte de la resistencia fue la presencia de mutaciones en la topoisomerasa gyrA de tipo II.El cribado in silico con el software Kleborate identificó mutaciones simultáneas GyrA83F y GyrA87A (n = 150), y mutaciones únicas GyrA83I (n = 91) y GyrA83Y (n = 15) como las más comunes.Casi todos los aislamientos con mutaciones gyrA tenían diámetros de zona de inhibición por debajo de 10 mm, mientras que el punto de corte de resistencia es de 22 mm.En 54 aislamientos probados que tenían tanto la mutación gyrA como el gen qnrB, casi todos tenían diámetros de zona de inhibición de 6 mm, lo que demuestra una clara combinación de resistencia.El genotipo oqxAB da una pequeña disminución en la susceptibilidad, pero la mayoría de estos aislamientos seguían siendo susceptibles.Finalmente, qnrB y qnrS disminuyeron sustancialmente el diámetro de la zona de inhibición.En nuestro conjunto de datos, estos genes estaban presentes solo en combinación con oqxAB, lo que lleva a diámetros de zona de inhibición reducidos de ~ 50% en comparación con oqxAB solo.Como no teníamos aislamientos con ambos genes qnr, no pudimos confirmar si su efecto es acumulativo.Además, se probaron 36 y 24 aislamientos con levofloxacina y norfloxacina, respectivamente, y el 42 % de cada grupo mostró susceptibilidad.En contraste con la ciprofloxacina, la levofloxacina solo se vio moderadamente afectada por las mutaciones de gyrA con un diámetro de zona de inhibición promedio reducido a 14 mm (Fig. S4).Examinamos la diversidad del gen parC que se ha asociado con la resistencia a las fluoroquinolonas 5,32 y encontramos 244 aislamientos que portaban tanto la mutación ParC80I como la mutación gyrA.Los alelos parC eran específicos de ST excepto por tres aislados periféricos de ST307 que difieren en un solo SNP de los otros diecisiete ST307 y quince aislados de ST15 (Fig. S5), lo que sugiere una falta de presión selectiva sobre el gen.Un árbol construido usando secuencias gyrA formó clados claros para los abundantes tipos ST14 y ST15 (Fig. S5).Los aislamientos de ST14 formaron dos clados principales, uno relacionado con las décadas de 1980 y 2010 (n = 14) y otro de la década de 2000 (n = 15).ST15 formó tres clados, uno vinculado a la década de 1980 (n = 13) y otros dos posteriores al año 2000 (n = 18, n = 131).Hubo evidencia adicional de presión selectiva en otras ST para las cuales teníamos menos aislamientos (Fig. S5).No pudimos probar el efecto de las mutaciones de parC sobre la resistencia porque todos los aislamientos con mutaciones en este gen también tenían mutaciones en gyrA.Finalmente, 237 aislados (46%) tenían un gen aac(6')-Ib-cr, de los cuales 132 fueron probados para resistencia a ciprofloxacino y 128 fueron resistentes.Este gen tuvo un impacto moderado en el diámetro del disco, pero este impacto es suficiente para que los aislamientos caigan por debajo del umbral de resistencia.Si bien la mayoría de los aislamientos portadores de aac(6')-Ib-cr también tenían mutaciones gyrA, encontramos 48 aislamientos con un genotipo oqxAB/qnrB/aac(6')-Ib-cr para los cuales el diámetro medio de la zona de inhibición fue de 13 mm en comparación con a 17 mm para 8 aislamientos con genotipo oqxAB/qnrB.Probamos aislamientos de Kp para resistencia a tetraciclina (n = 57) y tigeciclina (n = 48).Si bien los puntos de corte para la tetraciclina no están estandarizados31, los resultados indican una resistencia muy alta al antibiótico (Fig. S4).Los únicos cinco aislamientos susceptibles a la tetraciclina se recolectaron entre los años 1980 y 1982, lo que sugiere que en los 52 aislamientos restantes la resistencia es adquirida y no intrínseca.Los aislamientos con bombas de eflujo tetABD (n = 31/57) tenían perfiles marginalmente más resistentes.En contraste con la tetraciclina, la mayoría de los diámetros de la zona de inhibición de las pruebas de tigeciclina se ubicaron justo debajo del punto de ruptura, con solo unos pocos aislamientos con < 10 mm (Fig. S4).Kp no tiene un punto de corte de diámetro de zona EUCAST, por lo que usamos el punto de corte de 18 mm de E. coli en su lugar.Curiosamente, las bombas de eflujo tetABD no redujeron el diámetro de la zona de inhibición.Los aislamientos sin estas bombas de eflujo fueron marginalmente más resistentes (media de 14 mm frente a 17 mm), no menos resistentes.Entre los aislamientos probados con gentamicina (n = 349) y amikacina (n = 29), el 89 % y el 55 % fueron resistentes, respectivamente.En aquellos aislamientos que no tenían determinantes conocidos de resistencia a la gentamicina (n = 28), el diámetro promedio de la zona de inhibición fue de 15 mm frente a un punto de corte establecido de 18 mm (Fig. 4).Dos acetiltransferasas estaban presentes en nuestros aislados ((AAC(6')-I, n = 283; AAC(3)-II, n = 291), de las cuales AAC(3)-II fue un determinante más fuerte de resistencia, con casi todos los diámetros de la zona de inhibición por debajo de 10 mm AAC(6')-I redujo el diámetro de la zona de inhibición de 15 a 12 mm, y el efecto fue acumulativo con AAC(3)-II Nucleotidiltransferasa ANT(3'')-I y fosfatasas APH(6')-I y APH(3')-I, incluso combinados, parecen tener un efecto marginal sobre la resistencia. El gen armA de la metiltransferasa del ARNr 16S estaba presente en dos aislamientos, y el gen rmtB estaba presente en dos aislamientos adicionales. .Usando las herramientas VFDB, Kleborate y BLAST, examinamos el conjunto de datos para genes de virulencia33,34,35.El locus de las fimbrias tipo 1, fimABCDH, estuvo presente en casi todos los aislamientos (501/509, 98%).Estuvo ausente en aislamientos de ST960 (4/4), ST15 (3/161) y ST76 (1/3).De manera similar, el locus de fimbrias de tipo 3, mrkABCDF, estuvo presente en todos los aislamientos excepto en uno (ST147).Por el contrario, el locus de captación de hierro kfu estuvo presente en 245 (50%) aislamientos.Este locus estaba perfectamente correlacionado con ST;ningún ST tuvo aislamientos kfu positivos y negativos simultáneamente.Entre los ST más frecuentes, ST15 (n = 161), ST13 (n = 26) y ST14 (n = 26) tenían un locus kfu, pero estaba ausente en ST147 (n = 36), ST348 (n = 22) , y ST307 (n = 20) aislados.Solo había unos pocos genes de virulencia poco comunes.Por ejemplo, no encontramos ningún regulador de hipermucoviscosidad rmpA y rmpA2.Dos aislamientos (Kp4248 y KpV9) presentaron sideróforos de aerobactina: uno con iucA2 (ST3) y el otro con iuc3 (ST3027).Ambos aislamientos tenían determinantes AMR conocidos limitados.ST3 solo tenía blaSHV-1 y ST3027 tenía APH(6')-Ia/d, tet(A) y blaSHV-33.El locus de salmoquelina iroBCDEN se encontró solo en algunos aislados de ST48 (n = 7/9), todos los cuales portaban ESBL blaCTX-M-15.De estos 7 aislamientos, 6 procedían del mismo hospital de Lisboa entre los años 2005 y 2009. La yersiniabactina estuvo presente en el 56 % de los aislamientos y se transportó con mayor frecuencia en los elementos integrativos conjugativos ICEKp3, ICEKp4 e ICEKp12 en un 21 %, 15 % y 6 %. de todos los aislamientos, respectivamente.La detección adicional contra la base de datos de virulencia VFDB solo reveló los genes astA y cseA en un aislado.En este trabajo, hemos analizado los datos de la secuencia del genoma completo de aislamientos de 509 Kp recolectados entre los años 1980 y 2019 de los sistemas hospitalarios en las regiones del sur, centro y norte de Portugal, así como de clínicas veterinarias y una planta de tratamiento de aguas residuales en la región sur. .Debido a que esta es una de las colecciones secuenciadas más grandes del país, nos permitió investigar y comprender la diversidad genética temporal y espacial de este importante patógeno.Observamos que el 31% de los aislamientos pertenecían a ST que se consideran infrecuentes en Portugal.Si la diversidad de ST del conjunto de datos fuera impulsada por mutaciones dentro de los genes determinantes de ST, esperaríamos que la mayoría de las muestras difieran en un solo alelo, pero este no fue el caso.Esta observación está respaldada por las distancias SNP entre diferentes ST.En cambio, es más probable que la diversidad sea impulsada por la recombinación o la coexistencia de muchas cepas.La presencia simultánea de tantas ST en el país sugiere importación y grandes reservorios ambientales o humanos de infección.Esto último es consistente con las altas tasas de colonización observadas en diferentes países y entornos36.Los aislamientos de origen no humano de entornos de aguas residuales y animales no se destacaron en el análisis, lo que sugiere un flujo de Kp entre humanos y reservorios ambientales.Sin embargo, el número limitado de aislamientos de origen no humano no nos permitió determinar la dirección de este flujo.Nuestro análisis de secuenciación WGS reveló información sobre el genotipado y el fenotipado de AMR.Durante el período con mejor cobertura de aislamiento, años 2000 a 2019, los determinantes dominantes de resistencia a betalactámicos y carbapenémicos fueron blaCTX-M-15 (41%) y blaKPC-3 (21%).En aislamientos de los años 1990 a 1999, la mayoría (11 de 16) tenían blaTEM-10, que se cree que es la BLEE dominante durante ese período.Nuestro análisis de plásmidos revela una distribución compleja y en mosaico entre los aislamientos que sugiere una selección activa entre ellos.El aumento en la prevalencia de blaKPC-3 se ha visto acompañado por una disminución en la frecuencia de blaCTX-M-15 más antigua, que codifica betalactamasa de espectro más estrecho.Observamos un agrupamiento muy fuerte de aislamientos por sus replicones de plásmidos detectados.La nomenclatura de nombres de plásmidos se basa en mecanismos de replicación compartidos e incompatibilidad37, por lo que esperábamos observar alguna estructura.Los propios replicones revelaron un patrón rígido que es clínicamente relevante debido al transporte de blaKPC-3 en dos tipos de plásmidos.Los aislamientos con replicones FIA (pBK30683) y FII (pBK30683) fueron posibles fuentes de blaKPC-3, mientras que los aislamientos con IncN e IncFIB (pKPHS1) se restringieron a los tipos ST147.Sin embargo, los aislados con blaKPC-3 tenían exactamente el mismo alelo de replicón presente durante al menos 10 años y formaron un grupo muy claro de aislados (denominado grupo de replicón 9).Si bien los resultados de nuestra prueba AMR pueden sufrir cambios en la cantidad de compuesto activo en los ensayos de disco de prueba a lo largo de los años, encontramos resultados interesantes y sólidos.Como era de esperar, encontramos que blaKPC-3 era el gen de carbapenemasa dominante8,12,13, pero también observamos una reducción en el transporte de ESBL blaCTX-M en aquellos aislados que adquirieron blaKPC-3.Este desplazamiento de blaCTX-M indica selección activa, y el transporte conjunto de blaCTX-M y blaKPC-3 fue muy raro.Si bien el genotipo AMR fue en gran medida consistente con el fenotipo, observamos que la cefoxitina, una cefalosporina de segunda generación retirada, muestra una actividad moderada en aislamientos que carecen de betalactamasas de clase C.proc.nacionalAcademiacienciaEE.UU.actualOpiniónActualizaciones.Medicina.Frente.Dis.emergenteInfectar.Dis.Microorganismos.Frente.J.Hosp.Infectar.Microorganismos.J. Clin.emergenteInfectar.Dis.PLoS Genet.Evol.2018;físicaÁcidos Nucleicos Res.Ácidos Nucleicos Res.2018.Nat.Microbios intestinales.cienciaJ. Clin.Ácidos Nucleicos Res.mol.Biol.Evol.Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.